השפעת משך אינדוקציה לאקינטים על רמת ביטוי הגנים המעורבים בסינתזה ובפירוק של ציאנופיצין ובסינתזה של פיקוציאנינים באצה הכחולית Aphanizomenon ovalisporum

Transcript

1 בס"ד ישיבה תיכונית חספין טלפון: חספין ד.נ. רמת הגולן דוא"ל: השפעת משך אינדוקציה לאקינטים על רמת ביטוי הגנים המעורבים בסינתזה ובפירוק של ציאנופיצין ובסינתזה של פיקוציאנינים באצה הכחולית Aphanizomenon ovalisporum תחום דעת: ביולוגיה 2016 בלום אלחנן מנחה: ד"ר עכסה לופו רמת מגשימים

2 1 דיון תוכן עניינים תקציר...2 סקר ספרות...3 הציאנובקטריה 3... Aphanizomenon ovalisporum מחזור החיים של האצה...4 האקינטים גופי הקיימא...4 החומרים פיקוציאנין וציאנופיצין וביטוים באקינטים... 6 הקשר בין ביטוי גנטי לחלבונים ושיטות מולקולאריות...8 מטרת המחקר...11 שאלת המחקר...11 שיטות וחומרים...12 שלב 1: השרית אקינטים בציאנובקטריה...12 שלב 2: לקיחת דגימות במהלך זמן ההשריה שלב 3: הפקת RNA מהדגימות וקביעת רמת ביטוי הגנים לאקינטים בשיטת ה RT-PCR 3-1 הפקת RNA 3-2 שיטת ה- RT-PCR : בדיקה איכותית של ה- cdna באמצעות שיטת אלקטרופוריזה : בדיקה כמותית של ה- cdna באמצעות שיטת.QPCR...13 בניית עקומת כיול...13 ראקציית ה- QPCR...14 תוצאות ביטוי גנים המקודדים לביוסינתזה של ביטוי גנים ביטוי גנים חצי פיקובילינים...16 כמותי מלא...16 כמותי...18 ביטוי גנים המקודדים לביוסינתזה ודגרדציה )פירוק( של ציאנופיצין ביטוי גנים ביטוי גנים חצי כמותי מלא...19 כמותי...21 ומסקנות...23 פיקוציאנין...23 ציאנופיצין...25 יתרונות המחקר ומגבלותיו...26 כיווני מחקר בהמשך...27 ביבליוגרפיה...28

3 2 תקציר רקע: בקיץ 94' ארעה פריחה של האצה הכחולית Aphanizomenon ovalisporum )אפניזומנון( בכנרת. כיוון שאצה זו מפרישה רעלנים אל המים, הוחלט לחקור אותה כדי למנוע פריחות חוזרות שלה. האקינטים הם תאי קיימא הנוצרים באפניזומנון, כאשר תנאי הסביבה נעשים קשים לפריחת האצה. האקינטים מסוגלים לשרוד בסביבה חיצונית קשה כגון יובש וחסר בנוטריינטים. הם נושרים אל קרקעית האגם עד להיווצרות תנאים מתאימים לנביטה. התנאים הסביבתיים והתגובות התאיות המעורבות ביצירת אקינטים לא נחקרו לעומק ואינם מאופיינים היטב. מחקר זה בדק את ביטוי הגנים CphA, CpcB,CpcA ו- CphB במהלך האינדוקציה לאקינטים. מטרת המחקר: לאסוף מידע על האצה ועל תהליך התמיינותה לאקינטים ובפרט על המערכת הפוטוסינתטית ועל חילופי החנקן בתהליך. בהמשך - שימוש בידע זה במטרה למנוע התפרצויות חוזרות. שיטות וחומרים: לשם הבדיקה הודגרה תרבית של האפניזומנון במצע BG ללא אשלגן )התנאים לאינדוקציה של אקינטים( ונלקחו ממנה דגימות בזמנים שונים בין 0 ל 14 יום, )משך ההתמיינות לאקינטים( וכמו כן נלקחה דוגמא מאקינטים מבודדים. על מנת לבדוק את רמת ביטוי הגנים, נספרו עותקי ה mrna של הגן הנבדק בכל זמן באינדוקציה וחולקו במספר העותקים של ה rrna באותו זמן. מספר עותקי ה- mrna נקבע בשיטת. RT-QPCR תוצרי ה- RT-PCR הורצו גם באלקטרופוריזה על מנת לוודא שמתקבלים התוצרים הרצויים. תוצאות עיקריות: - CpcA אין הבדל מובהק בין זמני האינדוקציה השונים. - CpcB רמת הביטוי באקינטים גבוהה באופן מובהק מזו שב T0 )תחילת האינדוקציה( ויש עלייה הדרגתית ברמת ביטוי הגן. CphA1. רמת הביטוי באקינטים גבוהה באופן מובהק מזו שבשאר הזמנים באינדוקציה )למעט T7 שנחשב כטעות עקב סטיית התקן הגבוהה שלו(. CphB רמת הביטוי ב- T14 )ארבע עשר יום מתחילת האינדוקציה( ובאקינטים גבוהה באופן מובהק מזו שבשאר הזמנים. מסקנות: 1.ייצור הפיקוציאנין במערכת הפוטוסינתטית מעיד לכאורה על הגברת הפעילות העכשווית של המערכת באקינטים, אך התוצאות יכולות לנבוע גם מסיבות אפשריות אחרות כגון ייצור לצורך המערכת הפוטוסינתטית לכשתתעורר. לכן - הממצאים אינם מעידים בהכרח על פעילות פוטוסינתטית עכשווית. 2. הציאנופיצין מיוצר ומפורק כל הזמן, וזאת מפני שהאקינט זקוק לכמויות גדולות מהציאנופיצין במהלך התמיינותו לצורך בניית מבנים חלבוניים או חנקניים המאפשרים לו הישרדות במהלך התרדמת )ולכן הפירוק( אך עם זאת הוא זקוק למאגרים גדולים לצורך פעילות מטבולית בסיסית במשך זמן תרדמתו ולצורך בניית מערכות שונות בעת הנביטה )ולכן הייצור הגבוה(.

4 ב. 3 הציאנובקטריה Aphanizomenon ovalisporum סקר ספרות בקיץ 1994 התרחשה בכנרת פריחה של ציאנובקטריה )אצה כחולית( מהסדר Nostocales שזוהתה כ Aphanizomen onovalisporum )אפניזומנון(. "פריחה של אצות" הינה תופעה של שגשוג והתרבות של אצה כלשהיא במים. ציאנובקטריה מהסדר Nostocales נצפו בכנרת כבר בשנות ה- 70 המוקדמות אם כי בביומסות קטנות, ולאחר מכן הן נעלמו )הדס וחוב', 2011(. בשנת 1994 שילוב תנאים הוביל לפריחה של הציאנובקטריה A.ovalisporum לראשונה בכנרת ומאז היא מופיעה באגם מדי שנה )לופו וחוב', 2010(. ציאנובקטריה מהווה את הקבוצה הכי גדולה של פרוקריוטיים פוטוסינטתיים. תאים פרוקריוטים מאופיינים בכך שאין להם אברונים בתא )כגון מיטוכונדריה וכלורופלסטים( וה- DNA מפוזר בתא, בניגוד לתא האאוקריוטי המכיל אברונים ושרוב DNA שבו מאורגן בתוך גרעין ושאר ה DNA שבו מצוי בתוך האברונים )ברנהולץ וחוב', 2001( פרוקריוטים, התיעתוק והתרגום של גנים שונים נעשים בשרשרת אחד אחרי השני באותו אזור בתא.)Sukenik et al, 2009( עם התחממות כדור הארץ הציאנובקטריה פולשות לאגמים בכל רחבי העולם ומשתלטות עליהם. אצות כחוליות בגופי מים מתוקים בכלל ובכנרת בפרט הן מקור לדאגה מאחר והן משפיעות על איכות המים בכך שהן מפרישות רעלנים בעלי טווח פעולה רחב והשפעות בריאותיות על בעלי חיים ובני אדם הבאים עמם במגע )הדס וחוב', 2011(. התנאים לפריחת ציאנובקטריה מהסדר- Nostocales הם הימצאות של נוטריינטים, טמפרטורות מים גבוהות )בדרך כלל מעל 27⁰C(, חוסר רוח, מליחות גבוהה יחסית ואור. כמוכן, תנודות במפלס גורמות להרחפה של האקינטים, גופי הקיימא של האצה, כך שיוכלו לנבוט ביתר קלות )הדס וחוב', 2011(. נתון חשוב נוסף לגבי הסדר- Nostocales ה א,ו שלסדר זה ישנה היכולת לקבע חנקן אטמוספירי כאשר אין חנקן זמין במים, מה שנותן לו יתרון בסוף הקיץ כשריכוזי החנקן האנאורגני המומס נמוכים )א. הדס 2011(. הקיבוע מתבצע בתאים מיוחדים הנקראים הטרוציסטים. תאים אלה מפרקים את המערכת הפוטוסינטתית שלהם, מאחר שהניטרוגנאז )אנזים מקבע חנקן( רגיש לחמצן. מסיבה זו התא גם בונה מסביב שכבות נוספות של שרשראות ליפידים ארוכות. תא זה גדול יותר מהתאים הוגטטיביים שסביבו, והוא נראה חלול.)Sukenik et al, 2009(

5 4 מחזור החיים של האצה מחזור החיים של האצה הפולשת אפניזומנון מתחיל כאשר תנאי הסביבה נוחים, ואז מתרחשת נביטה של גופי הקיימא, האקינטים. במהלך הנביטה מתפתחות בהן בועיות גז הגורמות להתרוממותן לחלק העליון של עמודת המים, שם הן קולטות אור ומשגשגות. מושבות האצות נוצרות בצורת פילמנטים )שרשראות של תאים וגטטיבים(. כאשר תנאי הסביבה משתנים לרעה, חלק מהתאים הוגטטיבים מתמיינים לאקינטים ניתקים מהפילמנט, ושוקעים לקרקעית האגם, שם הם ממתינים בתרדמה עד לשיפור בתנאי הסביבה )סוקניק וחוב', 2007( )איור 1(. איור 1 : תיאור סכמתי של מחזור החיים של האפניזומנון. אקינטים מסומנים באדום, הטרוציסטים בשחור )סוקניק וחוב', 2007(. האקינטים גופי הקיימא האקינטים הם גופי קיימא המסוגלים לשרוד בתנאי סביבה קשים כגון יובש, חסר בנוטריינטים כגון זרחן, אשלגן וכו' )הדס וחוב', 2011; סוקניק וחוב', 2007(, דבר המעניק למינם יתרון סביבתי מובהק בתחרות מול אורגניזמים פוטוסינתטיים אחרים על המשאבים הסביבתיים בתנאים משתנים )לופו וחוב', 2010 (,ומאפשרים שרידות של המאגר הגנטי לתקופות ארוכות. האקינטים נוצרים בעיקר כאשר תנאי הסביבה אינם נוחים לאצה, כלומר, לקראת דעיכת הפריחה, אך עם זאת ישנם אקינטים כבר בשלבים הראשונים של הפריחה )לופו וחוב', 2010(. בהתחלה הם עדיין נמצאים בתוך הפילמנטים, אולם מאוחר יותר הם

6 5 מתנתקים מהפילמנט ושוקעים לקרקעית האגם, שם הם שוהים עד שהתנאים הופכים נוחים יותר לפריחת האצה. האקינטים יכולים לשהות בקרקעית האגם זמן רב ביותר )חודשים ושנים(, ולפרוח מתי שהאותות הנכונים יתקבלו )סוקניק וחוב', 2008(. חשוב לציין שהאקינטים נחשבים רדומים למרות שהם מקיימים פעילות מטבולית נמוכה )כגון פוטוסינתזה, נשימה וייצור שלחלבונים ושומנים( )2009 al,.)sukenik et באמצעות בדיקת כמות האקינטים השקועים בקרקעית בעומקים השונים ניתן לדעת )בערך( מה הייתה תפוצת האצה בשנים מסויימות, כל ס"מ עומק בסדימנט מייצג תקופה של שנתיים עד שלוש שנים )לופו וחוב', 2010(. אקינטים קשורים לפילמנטים של אפניזומנון מופיעים מס' שבועות מתחילת הגידול הוגטטיבי, ותכולתם משתנה משנה לשנה. תפוצת האקינטים המרבית היא לרוב בשיעור של אקינט לכל שני פילמנטים. תהליכים הקשורים לשלבי התרדמה וההתעוררות של האקינטים מתרחשים לעיתים בפרקי זמן של דקות או שעות )הדס וחוב', 2008(. התנאים הסביבתיים והתגובות התאיות המעורבות ביצירת אקינטים לא נחקרו לעומק ואינם מאופיינים היטב. כן נמצא שבתרביות מעבדה מחסור במינרלים זרחן ואשלגן היוו גורם סביבתי המשרה תהליך יצירת אקינטים. לעומת זאת, למחסור בחנקן מקובע לא הייתה השפעה כזו. בניסוי נוסף נמצא שגם למחסור במנת תאורה ישנה השפעה על השריית יצירת אקינטים )סוקניק וחוב', 2007(. כמוכן, חשוב לציין כי נמצא שבמהלך התפתחותם, האקינטים מגיעים לביומסה גבוהה פי 10 מאשר התאים הוגטטיביים הסמוכים להם )2007 al.,,)sukenik et וכן הם משכפלים את הגנום שלהם פי 5 עד פי 2012( 10 al.,.)sukenik et לאורך תהליך האינדוקציה )ההתמיינות( של האקינטים, זוהו מספר ימים בהם אובחנו שינויים משמעותיים בהתפתחותם; יום 0 פילמנטים רגילים של אפניזומנון. יום 5 נצפים תאים שמתחילים לפתח שכבות נוספות של מעטפת, ומתחילים לגדול. יום 9 האקינטים גדולים יותר, מפותחים יותר וניתן כבר לראות מספר אקינטים בוגרים. יום 14 -יש הרבה אקינטים בוגרים, חלקם חופשיים. תרבית אקינטים אקינטים בוגרים ובשלים, משוחררים מהפילמנט. בודדו ביום 14 )איור 2(.

7 אקינטים איור 2: התפתחות תאי אפניזומנון במהלך התמיינות לאקינטים. דגימות נלקחו בימים: 0,5,9 ו- 14. כמו כן נראים אקינטים מבודדים. חיצים אדומים מציינים שלבים מוקדמים של התפתחות אקינטים. חיצים כחולים מראים שלבים מאוחרים יותר של התבגרותם. החומרים פיקוציאנין וציאנופיצין וביטוים באקינטים שימוש במיקרוסקופ פלורסנטי הראה שכאשר מאירים תרבית באור ירוק או כחול אקינטים בוגרים אינם זוהרים, בניגוד לתאים וגטטיביים שזוהרים באור אדום או צהוב )בהתאמה(. זוהר התאים באדום או צהוב נובע מנוכחות פיקובילינים וכלורופיל בהתאמה. הפיקובילינים הם קבוצת פיגמנטים המהווה חלק מהמערכת הפוטוסינתטית. פיקובילינים מחוברים תמיד לחלבונים, ויחד איתם הם יוצרים מבנה המכונה פיקובילפרוטאין ( Glazer,.)1989 הפיקוביליפרוטאינים הם אבני הבניין של הפיקוביליזום. כל פיקוביליפרוטאין מכיל שתי שרשראות פוליפפטידיות αו- β בגודל 17 ו- 18 קילודלתון בהתאמה. כל שרשרת פוליפפטידית כזאת קשורה בקשר קובלנטי למולקולת בילין אחת או שתיים. קיימים מספר סוגים של פיקוביליפרוטאינים הנבדלים זה מזה במספר ובסוג הבילינים הקשורים למונומר אחד של.αβ סוגי הפיקוביליפרוטאינים והרכביהם מופיעים באיור ) )Glazer,

8 7 איור 3: מספר וסוג הבילינים המחוברים לפיקוביליפרוטאינים השונים. אחד מהפיקוביליפרוטאינים הבולטים הוא ה- C-phycocyanin )פיקוציאנין(,פיגמנט המשתתף בתהליך הפוטוסינתזה וקולט אור באורכי גל של 620 ננומטר )1989.)Glazer, ה-- C Phycocyanin מורכב משלוש שרשראות α ושלוש שרשראות β, ולכל מונומר αβ קשורות שלוש מולקולות של הבילין.)Glazer, )1989 Phycocyanobilin כאשר תמציות חלבון שהופקו מתרבית צעירה ומאקינטים מבודדים הורצו באלקטרו פורזה על ג'ל מפוליאקרילאמיד הופיעו חלבונים בגודל של קצת פחות מ קילו-דלטון בתרבית הצעירה אך לא הופיעו באקינטים, מקטע זה יוחס לפיקובילינים והיעלמותו באקינטים הובילה למסקנה כי הפיקובילינים נעלמים. )2007 al,.)sukenik et לכן, הועלתה ההשערה שביטוי הגנים )CpcA(C-Phycocyanin α chain ו- )CpcB( C-Phycocyanin β chain )המייצרים את שרשראות ה- α וה- β בפיקוציאנין בהתאמה( מוגבר בתאים וגטטיבים ופוחת באקינטים. חומר נוסף שנמצא בו הבדל בין רמת הימצאותו בתאים וגטטיביים לבין רמת הימצאותו באקינטים הוא cyanophycin )ציאנופיצין( פולימר של חומצות האמינו ארגינין ואספרטאט. הציאנופיצין משמש כחומר תשמורת לחנקן, ומסיבה זו הוא חומר חשוב ביותר לאצה )סוקניק וחוב', 2007(. במחקר קודם שנעשה בתחום נמצא כי תפוצתם היחסית של חומצות האמינו אספרטאט וארגינין גבוהה יותר באקינטים בוגרים מאשר בתאים הוגטטיביים, ושוער שעלייה זו קשורה בצבירה של ציאנופיצין באקינטים )סוקניקוחוב', 2007(. מכאן אפשר לשער, שביטוי הגן ל,CphA1( Cyanophycin synthase ההעתק הראשון בגנום האפניזומנון ל- )cpha המייצר ציאנופיצין גובר וביטוי הגן ל- )CphB( Cyanophycinase המפרק ציאנופיצין פוחת.

9 8 הקשר בין ביטוי גנטי לחלבונים ושיטות מולקולאריות ( DNA )הוא Deoxyribonucleic acid החומר התורשתי, המטען העובר בין הורים לצאצאיהם. ה- DNA מצוי בצורת סליל כפול הבנוי מהנוקלאוטידים: אדנין, תימין, גואנין וציטוזין G.)A,T,G,C( נקשר ל- C ו- A נקשר ל- T. על זה מתבסס מבנה הסליל הכפול, ביטוי הגנים ועל זה גם מתבססות השיטות המולקולאריות )עתידיה וחוב', 2004(. נוקלאוטיד הוא תרכובת של זרחה עם הסוכר ריבוז ובסיס חנקני.)C/G/T/A( רצף נוקליאוטידים ב DNA המתועתק ל- mrna נקרא גן )עתידיה וחוב', 2004(. ישנם שלושה הבדלים בין RNA ל-.DNA הראשון הוא: הרכב הסוכר. ב-,RNA הסוכר הוא ריבוז, וב-,DNA הסוכר הוא דאוקסיריבוז )ריבוז עם קבוצה הידרוקסילית אחת פחות(. ההבדל השני ה א:ו הסליל DNA הוא בעל סליל כפול )דו-גדילי(, ו- RNA הוא בעל גדיל אחד בלבד. ההבדל השלישי הוא: בסיסי החנקנים. בעוד ב- DNA קיימים הנוקליאוטידים,A,T,G,C ב- RNA קיימים הנוקלאוטידיםA,U,G,C U =אורציל( ( )איור 4(. איור 4: ההבדלים בין RNA ל- DNA. )mrna( Messenger Ribonucleic acid הוא תוצר תיעתוק של הגן.)DNA( התיעתוק הוא תהליך, שבסופו נוצר mrna וזה מתורגם לחומצות אמינו ליצירת חלבונים. בתהליך זה, האנזים RNA polymerase פותח את גדיל ה- DNA הכפול ומתחיל בתהליך התיעתוק של הגן התהליך כולל קשירת נוקליאוטידים לנוקליאוטידים המתאימים ב DNA ויצירת גדיל RNA משלים על ידי חיבור בין הנוקליאוטידים. בתום תהליך התיעתוק ה- mrna מתורגם בריבוזום, בעזרת מולקולות,tRNA הנושאות חומצות אמיניות ומזהות את הקודון בעזרת

10 9 האנטיקודון הנמצא עליהן. הקודון הינו רצף של שלושה נוקלאוטידים, ולכל חומצה אמינית יש רצף/ים של שלושה נוקליאוטידים מתאימים. כך, מתורגם הרצף מחומצות גרעין לחלבונים )עתידיה וחוב', 2004(. מכאן נגזר שאם גן מסוים מתבטא בתא, נמצא רמות גבוהות של רצף ה mrna שלו. ניתן לבדוק את ביטוי הגן בתא באמצעות העלאת כמות הגן באופן ידוע למספר שניתן לכמת אותו. שיטה זו היא ה- RT-PCR. תהליךה- RT-PCR הוא תהליך in vitro שתפקידו הוא להגביר רצפים מוגדרים של.)Rappolee et al. )1988 RNA שיטה זו, כנובע משמה, מתחלקת ל- 2:.PCR ו-,RT RT הוא ראשי תיבות של reverse transcription )תיעתוק הפוך(, כלומר: יצירת DNA תוך שימוש ב- RNA כתבנית. באמצעות פריימר )תחל: רצף של כ- 20 נוקלאוטידים המתאים לגן ספציפי( אחורי של הגן הנבדק primer(,)reverse הנצמד לגדיל ה- RNA שתועתק מאותו גן, האנזיםtranscriptase,reverse המתמחה בתהליך ה- reverse transcription האמור, ונוקליאוטידים, מיצר גדיל DNA בעל רצף "משלים" ל- RNA ומכאן שמוDNA complimentary או בקיצור cdna )עתידיה וחוב', 2004(. PCR הוא ראשי תיבות של Polymerase Chain Reaction )תגובת שרשרת על ידי פולימראז(.מטרתו של תהליך זה הוא לייצר מספר רב של עותקים מהגן הנבדק. זהו תהליך בו הגן שרוצים לבדוק בתוך המבחנה משוכפל כל סיבוב. סיבוב כולל: פתיחתה- DNAב- 95 C, קשירת הפריימרים אליו, בטמפרטורת הקשירה שהיא ספציפית לכל פריימר, ושכפולו על ידי האנזים DNA Polymerase ב- 72 C וחוזר חלילה )2012.)Madigan, תהליך ה- RTPCR תוך שימוש בפריימרים ספציפיים לגנים הנבדקים, מאפשר לבדוק את רמת ביטוי הגנים )2000 )Bustin, ביחס לגן המתבטא באופן קונסטיטוטיבי )קבוע( כגון התת היחידה הקטנה של ה- RNA הריבוזומלי 16S, rrna גן שביטויו בפרוקריוט גבוה בכל מקרה שהוא. הריבוזום הינו קומפלקס חלבוני האחראי על תרגום ה- RNA לחלבון )נדלה מאתר "green.)gene" התא אינו יכול להתקיים ללא חלבונים. כיוון שכך, עליו לייצר כל העת ריבוזומים כדי שיוכלו לתרגם את החלבונים עבורו. ה- 16SrRNAהוא חלק מהריבוזום, ומשום כך נקבע כי רמת ביטויו בתא היא גבוהה ואינה משתנה ברוב המקרים. כיוון שרמת ביטוי ה- 16S rrna לא משתנה משמעותית, נהוג להשוות ביטוי של גנים אחרים ביחס אליו )לנרמל(. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא הקטנת האפשרות לשגיאות הנובעות מכמות ה- RNA שהופק מאותו תא.

11 10 רמת ביטוי הגן יכולה להיבדק בצורה כמותית וחצי כמותית. הבדיקה הכמותית מתבצעת על ידי QPCR ראשי תיבות,Quantitative Polymerase Chain Reaction כלומר: PCR כמותי. בתהליך זה מוסיפים סייבר גרין לריאקציית הPCR, שהינו סמן פלואורסצנטי הנקשר ל- DNA דו-גדילי ומאפשר לעקוב אחר תהליך ההגברה )שכפול( על ידי המכשיר. בעזרת עקומת כיול שהיא סדרה של דוגמאות בעלות מספר ידוע של עותקים של הגן הנבדק )במקרה זה הגנים )cpca, cpcb, cpha1, cphb ניתן לכמת את התוצאות שיצאו ב- PCR לכמות עותקים מספרית. הכימות מתבצע ב- cycle threshold :CT ומשמעותו- אותו סיבוב בו נצפית עליה בפלואורסנציה מעל לסף מסוים. )2000.)Bustin, הבדיקה החצי כמותית מתבצעת על-ידי הרצת תוצרי הRT-PCR באלקטרופוריזה. תוצרי ה RT-PCR מוטענים על ג'ל העשוי אגרוז המייצר רשת סבוכה ואז מושרה עליהן שדה חשמלי. כשהחשמל זורם, הפוספטים השליליים של מולקולת הDNA נעים לעבר הקתודה בעלת המטען החיובי, ה DNA נע בהתאם לגודלו. מרחק נדידה של מולקולה ארוכה הינו קצר מזה של מולקולה קצרה. על מנת לראות את מולקולת ה DNA ומרחק נדידתה מוסיפים צבען הנקשר אל הDNA ובאור אולטרה-סגול ניתן לראותן )2012.)Madigan, על מנת לזהות את אורך מולקולת הDNA הנבדקת מריצים בג'ל סמן DNA המכיל מקטעים של DNA באורכים ידועים. כך ניתן לדעת אם תוצר ה PCR הוא באורך הרצוי. עוצמת הצבע פרופורציונית לכמות התוצרים שהתקבלו. כזכור, הועלתה ההשערה שפעילות המערכת הפוטוסינטתית פוחתת במהלך תהליך ההתמיינות לאקינטים כלומר: ביטוי הגנים CpcAו- CpcB )המייצרים את שרשראות ה- הוα -β בפיקוציאנין בהתאמה( מוגבר בתאים וגטטיבים ופוחת באקינטים. נוסף על כך, עקב תפוצתם הגבוהה יחסית של חומצות האמינו ארגינין ואספרטאט באקינטים, הועלתה השערה נוספת כי ישנה עלייה בייצור הציאנופיצין במשך תהליך ההתמיינות לתאים אלה. כלומר:ביטויהגן CphA1 המקודד ל Cyanophycine synthetase המייצר ציאנופיצין - גובר, ולעומתו ביטוי הגן ) CphB (המפרק Cyanophycinase ציאנופיצין - פוחת. בעזרת השיטות שהוסברו לעיל RT-QPCR( ואלקטרופוריזה( נבדקה רמת ביטוי הגנים,CphA1,cphB,cpcB,cpcA וכך ניתן היה לאמת או לשלול את ההשערות לעיל.

12 11 המחקר מטרת בדיקת תהליכים מטבוליים המתרחשים בזמן התמיינות תאים לאקינטים בציאנובקטריה.Aphanizomenon ovalisporum הכרת מחזור החיים של הציאנובקטריה, תאפשר בעתיד שליטה ובקרה בעת התפרצויות חוזרות. המחקר שאלת מהי רמת הביטוי של הגנים (CpcB), C-Phycocianin α chain (CpcA), C-Phycocianin β chain (CphB),Cyanophycin synthase (CphA), Cyanophycinase בתהליך יצירת האקינטים באצה הכחולית אפניזומנון אובליספורום.

13 12 שלב 1: השרית אקינטים בציאנובקטריה שיטות וחומרים תרבית של Aphanizomenon ovalisporum גודלה במצע BG-11 עד לשלב הלוגריתמי )כ- 10 ימים ב- 28 C באור בעוצמה של molephoton m-2 S-1 5.7( μ והועברה ל- 20 C שם שהתה במשך שלושה ימים באור באותה עוצמה לשם הסתגלות. לאחר מכן הועברה התרבית למצעBG-11 ללא אשלגן והודגרה ב - 20 C בעוצמת אור של molephotonxm- 26µ 1-S 2x למשך כשלוש השבועות לשם השריית אקינטים. שלב 2: לקיחת דגימות במהלך זמן ההשריה לאקינטים. כל חמישה ימים נלקחו 5ml מהתרבית מושרית האקינטים, התאים הושקעו בצנטריפוגה ולאחר מכן המשקע הועבר ל- 80 C-, שם אוחסן עד המשך הטיפול. כמוכן בתום שלושה שבועות בודדו אקינטים מהתרבית בשיטה סטנדרטית להפקת אקינטים Sukenik et al (2007(. דגימה מהאקינטים נלקחה גם כן ואוחסנה אף היא ב- 80 C-. ביטוי הגנים נבדק בשיטת ה-.RT-PCR רשימת הפריימרים בהם נעשה שימוש מופיעה בטבלה 1. שלב 3: הפקת RNA מהדגימות וקביעת רמת ביטוי הגנים בשיטת ה- RT-PCR 3-1 הפקת RNA RNA הופק מהדגימות שנלקחו קודם לכן מהתרבית מושרית האקינטים ומהאקינטים )באמצעות שימוש בקיט Plant RNeasy של QIAGEN לפי הוראות היצרן, לפי הפרוטוקל של הפקת RNA מצמחים ומפטריות, כולל השלב של הסרת DNA גנומי באמצעות RNase Free שימוש בקיט- DNA תוך לאחר ההפקה בוצע טיפול נוסף בDNase.)QIAGEN של DNase set Free של )Ambion( לפי הוראות היצרן. 3-2 שיטת ה- RT-PCR תכנון הפריימרים רצף הגנים השונים נלקח מטיוטת הגנום של ה- Aphanizomen onovalisporum והוא שימש כבסיס לתכנון הפריימרים באמצעות תוכנת.Primer3 תיעתוק הפוך - transcription Reverse

14 13 התיעתוק ההפוך בוצע תוך שימוש באנזים reverse transcriptase שבודד מהווירוס: Moloney Murine Leukemia Virus )ביולב ירושלים( על פי הוראות היצרן תוך שימוש בפריימר אחורי של הגן הנבדק בו השתמשנו בריאקציית ה.QPCR- PCR ה- cdna של הגן הנבדק עבר הגברה על ידי PCR באופן הבא: 25μl תערובת ראקצית ה- 50mM Tric-HCl ph בופר הוא: )הרכב 1X,PCR בופר 2.5µl,cDNA דוגמת 2µl כללה PCR,8.3 KCl 3mM MgCl2,500μg/ml BSA 0.5% Ficoll 1%Sucrose 30mM ו- 1mM טרטראזין(, (forward פרימר קדמי 3µl,)400μM )ריכוז סופי של 10mM בריכוז dntp תערובת 1µl ( primerו- 3µl פרימר אחורי( primer (reverse בריכוז של 3 μm כל אחד )ריכוז סופי של.0.5μlTaq DNA polymerase ו- 360nMכלאחד( התערובת עברה דנטורציה ראשונית ב- 95 C למשך 5 דקות ולאחר מכן 35 סיבובים של דנטורציה ב- 95 C למשך 45 שניות, אנילינג ב- 60 C למשך 30 שניות והגברה למשך 30 שניות, ב 72 C, והארכה סופית למשך 5 דקות ב 72 C. 3-3: בדיקה איכותית של ה- cdna באמצעות שיטת אלקטרופוריזה תוצרי ה- PCR הורצו על ג'ל של 1.2% אגרוז בבופר 1xTAE ו 1.2xHydragreen, באמבט אלקטרופוריזה בבופר TAE כאשר הושרה עליהן שדה חשמלי של 100. volts כמוכן הורצו גם דוגמאות RNA )שלא עברו את תהליך ה- transcription )Reverse כבקרה שלילית, ו- DNA גנומי כבקרה חיובית. לצד הדוגמאות הורץ הMarker 100bp DNA Ladder שהוא תערובת של מקטעי DNA באורכים נתונים מ- 100bp ועד-.1500bp בתום ההרצה התבוננו בג'ל כאשר הוא מואר באור אולטרא סגול כדי לראות את תוצריה PCR שנצבעו ב.hydragreen כמו כן הג'ל צולם. יש לציין שההרצה באלקטרופוריזה בוצעה כדי לוודא שמקבלים את המקטע באורך הרצוי, לשם כימות התייחסנו יותר לתוצאות ה QPCR להלן. 3-4: בדיקה כמותית של ה- cdna באמצעות שיטת.QPCR בניית עקומת כיול דוגמאות עקומת הכיול היו דוגמאות שהכילו מספר עותקים ידוע של מקטע מהגן הנבדק שנוצר על ידי PCR תוך שימוש בדוגמת DNA של Aphanizomenon כתבנית, ובצמדי הפריימרים cpca F וR cpcb F,cpcA ו cpha F,cpcB R ו cpha R וF cphb ו cphb R על מנת ליצור פרגמנטים מהגנים ל-,C-phycocyanin alpha chain ל C-phycocyanin beta chainל- Cyanophycinsynthetase ול- Cyanophycinase בהתאמה )ראה טבלה 1(. מספר העותקים עבור כל דוגמא נקבע על פי הנוסחה: (2C/MW)xNA כאשר C הוא ריכוז דוגמת

15 14 המקטע, MW משקל מולקולרי של המקטע ו- NA הוא מספר אבוגדרו 6.02x הדוגמאות נמהלו במהולים עשרוניים. מלבד תפקיד עקומת הכיול בכימות התוצאות, העקומה היוותה גם בקרה חיובית עבור הניסוי. ראקציית ה- QPCR כדי לקבל אומדן כמותי של ביטוי הגנים דוגמאות ה- cdna הוגברו בעזרת.QPCR בנוסף למרכיבי ריאקציית ה- PCR שתוארה לעיל הוסף לתערובת הראקציה גם הסמן SYBR Green ברכוז 0.2. כמוכן, הבופר של ריאקצית ה- QPCR הכיל את כל המרכיבים האמורים מלבד טרטראזין. במקביל לדוגמאות ה cdna הורצו ב- QPCR דוגמאות של RNA )שלא עברו transcription- ) Reverse כבקרה שלילית עבור כל גן, וכמו כן הורצו דוגמאות של עקומת כיול עבור כל גן. צמדי הפריימרים ששמשו ל- QPCR עבור הגנים ל- C-phycocyanin,alpha chain ל-,C-phycocyanin beta chain ל- Cyanophycinsynthetase ול- CphA F, CpcB-sh R ו CpcB-sh F, CpcA-sh R ו- CpcA-sh F היו: Cyanophycinase ו- R CphA ו- cphb-seq-f ו- cphb-seq-r בהתאמה )ראה טבלה 1(. בנוסף לגנים הנבדקים דוגמאות ה- RNA עברו RT PCR תוך שימוש בפריימרים המגבירים את הגן ל-.rRNA16S המובהקות הסטטיסטית נבדקה בשיטת.ttest מובהקות סטטיסטית נקבעה אם ערכי ה- t test היו נמוכים מ יש לציין כי ריאקציות ה- ה- QPCR נעשו במכשיר Rotor-Gene 6000 של חברת Corbett ובתוכנה.Rotor-gene 6000

16 15 טבלה 1- רשימת הפריימרים שהשתתפו בניסוי. שם הפריימר שם הגן רצף הפריימר אורך המקטע )בבסיסים( מטרת צמד הפריימרים בנית עקומת כיול TGAAGCTATTGCCTCTGCT 5' - CAAACCATGATTGGCTTTC C-phycocyanin alpha chain CpcA F CpcA R בנית עקומת כיול 441 5' - GCAACTAGACGCTTTGACCA 5' - GCAGCAGCACGATCAAAGTA C-phycocyanin beta chain CpcB F CpcB R בנית עקומת כיול ובדיקת ביטוי הגן 358 5' - AAACCACTACGACCCGACT 5' - TTCAGCACTGCATAGCCAT Cyanophycin synthetase CphA F CphA R בנית עקומת כיול 320 5' - GGACACCCCAAGCAACTAA 5' - GCCACAAAGGCGTAATTGA Cyanophycinase CphB-F CphB-R בנית עקומת כיול ובדיקת ביטוי הגן 440 5' - GGGGAGCGAATGGGATTA 5' - TAAGGGGCATGCTGACTTG Small subunit ribosomal RNA(16S rrna) -F16S rrna -R16S rrna בדיקת ביטוי הגן 260 5'- GCAACACCGAATTACAAGC 5' - GGACCAGTACCACCAGCAA C-phycocyanin alpha chain cpca-sh F cpca-sh R בדיקת ביטוי הגן 268 5' - TGCAGCTCGTTCTTTGTTTG 5' - GTTAGCGAGGCCAATAGC C-phycocyanin beta chain cpcb-sh-f cpcb-sh-r בדיקת ביטוי הגן 300 5' - GGACACCCCAAGCAACTAA 5' - CGCCTCCAGTGAGAAATAC Cyanophycinase cphb-seq-f cphb-seq-r

17 16 תוצאות ביטוי גנים המקודדים לביוסינתזה של פיקובילינים ביטוי גנים כמותי מלא ניסוי זה נעשה במטרה לבדוק תהליכים מטבוליים המתרחשים בזמן התמיינות תאים לאקינטים באפניזומנון, במטרה להכיר את מחזור החיים של הציאנובקטריה, ובכך לאפשר בעתיד שליטה ובקרה בעת התפרצויות חוזרות. במהלך הניסוי בדקנו את ביטוי הגנים המקודדים ליצירת שרשראות אלפא וביתא של הפיקובילין פיקוציאנין, ואת ביטוי הגנים המקודדים לביוסינתזה )בנייה( ודגרדציה )פירוק( של חומר התשמורת החנקני ציאנופיצין. בדקנו את ביטויים לאורך האינדוקציה עלי די השריית אקינטים במצע BG- 11 ללא אשלגן, נטילת דגימות כל מס' ימים, הפקת RNA מהדגימות וקביעת רמת ביטוי הגנים באמצעות שיטות RT-QPCR ואלקטרופוריזה.את דגימות ה- RNA עם דוגמאות ה ביחד העברנו תיעתוק הפוך ולאחר מכן דוגמאות ה- cdna, RNA שלא עברו תעתוק עברו הגברה ב- PCR וב.QPCR התוצאות כומתו על ידי QPCR תוך שימוש בעקומת כיול, ונורמלו ביחס ל גןrRNA 16S. בשיטת האלקטרופוריזה, תוצרי הPCR הורצו באמבט אלקטרופוריזה כאשר הושרה עליהן שדה חשמלי. במקביל הורצו גם תוצרי 100bp גנומי. אורך המקטעים נמדד על ידי סולם גדלים DNA ו- RNA של דוגמאות PCR DNA Ladder )כל סדרה של מקטעים בגדלים שונים בהפרשים של 100 זוגות בסיסים זה מזה כאשר אורך המקטע הקטן ביותר הוא 100 זוגות בסיסים(. בתום ההרצה התבוננו בג'ל כאשר הוא מואר באור אולטרא סגול כדי לראות את תוצרי ה PCR שנצבעו. הג'ל צולם. cpca בניסוי שבדק את ביטוי הגן cpca לאורך זמן האינדוקציה לאקינטים בשיטת, RT-QPCR ניכר כי ישנה עלייה בביטוי הגן לאורך כל מהלך האינדוקציה )למעט בדוגמא שנלקחה לאחר 11 יום(. למרות העלייה המתמדת בביטוי הגן לא נצפתה מובהקות בתוצאות, ולכן אין הבדל בפועל בין ביטוי הגן בתרבית בשלב גידול וגטטיבי )זמן אפס( לבין ביטויו באקינטים, או בזמני הביניים לאורך האינדוקציה )איור 5(.

18 ak איור 5: ביטוי הגן cpca במהלך אינדוקציה לאקינטים על ידי.QPCR זמן האינדוקציה מבוטא בימים, וביטוי הגן נמדד ע"פ מספר העותקים של ה- RNA שנשא את קידודו ומנורמל ביחס לביטוי ה 16S. rrna cpcb בניסוי שבדק את ביטוי הגן cpcb לאורך האינדוקציה לאקינטים בשיטת,RT-QPCR נמצא כי ישנה עלייה מתמדת בביטוי הגן לאורך מהלך כל האינדוקציה. גם כאן, T11 יוצא דופן מכלל זה, ובהתחשב בעובדה שאותה דגימה הראתה סטייה דומה גם בביטוי הגן,cpcA החלטנו להתייחס אליה כאל טעות חריגה אקראית. הפעם, בניגוד ל- cpca, הייתה מובהקות סטטיסטית בין הביטוי ב- תוצאת ה- T0 T0 לביטוי באקינטים, מה שאומר שניתן להתייחס להבדל בין לאקינטים כאמינה. משום שישנה עלייה מתמדת המובהקת סטטיסטית, ניתן לומר שביטוי הגן cpcb עולה במהלך האינדוקציה לאקינטים. )איור 6(.

19 ak איור 6: ביטוי הגן cpcb במהלך אינדוקציה לאקינטים על ידי.QPCR זמן האינדוקציה מבוטא בימים, וביטוי הגן נמדד ע"פ מספר העותקים של ה- RNA שנשא את קידודו ומנורמל ביחס לביטוי ה- rrna 16S. ביטוי גנים חצי כמותי כאשר נעשה לשני הגנים cpcb ו- cpca אלקטרופוריזה, נמצא כי: ב- cpca ניתן לראות שהוגברו מקטעים באורך הנכון )260 בסיסים(. כרגיל באלקטרופוריזה, בדקנו כבקרה שלילית את ההגברה של הגנים על דוגמת ה RNA ללא תהליך ה-.RT כיוון שהאנזים Taq DNA polymerase משכפל רק DNA ולא,RNA לא אמור להיות תוצר בריאקציה זו. אך כנראה היה זיהום מזערי, ומשום שהוא עבר הגברה של 35 סיבובים, זה גרם לכך שהתקבל תוצר שנראה לעין. בנוסף, ניתן לראות בנדים )פסים( שלא באורך המבוקש )באזור בסיסים(. ההסבר המתקבל ביותר על הדעת לכך הוא, שחלק מהפריימרים נקשרו לחלק מהזיהום הנזכר לעיל ושכפלו אותו. כיוון שזה לא התבנית הנכונה, יצאו לנו בנדים לא באורך הנכון. מאפיין שלבים ראשונים של האמפליפיקציה )שכפול מקטעים ארוכים(.השפעה על התוצאות: מעיד על זיהום של,DNA אבל לשם כימות אנו מתייחסים יותר לתוצאות ה- QPCR לעיל, וכיוון שעל פי תוצאות ה- QPCR היה זיהום קטן יחסית של DNA )הפרש של 5 סיבובים בין דוגמת ה- cdna בעלת המספר הקטן ביותר של העותקים לדוגמת ה- RNA בעלת המספר הרב ביותר של העותקים(, אנו מתייחסים לזיהום כזיהום מזערי, שלא משפיע )איור 7(. הערה כללית: לשם כימות השתמשנו יותר בתוצאות ה- QPCR לעיל. תוצאות האלקטרופוריזה נועדו לוודא שבדקנו אם המקטעים באורך הנכון, ולתת תוצאה ויזואלית, לא לשם כימות, וזאת מפני שהתוצאות מושפעות מהכמות המגבילה של DNTP והפריימרים ששמנו בכל מבחנה. לאחר שדגימה ניצלה את כל ה- DNTP והפריימרים הזמינים, מספר העותקים לא יוכפל, אף אם עקרונית הוא אמור לגבור היות מוכפל. משום כך, בדיקת תוצרי

20 19 האלקטרופוריזה לאחר PCR איננה רלוונטית מבחינה כמותית. ב- cpcb המקטעים באורך הנכון )268 בסיסים(. כמוסבר לעיל, הזיהום הגבוה ב- RNA נובע מהגברה גבוהה ב- PCR, ולפיכך הזיהום חסר משמעות. )איור 7(. R D ak R D ak cpcb cpca איור 7: ביטוי הגנים cpca ו- cpcb במהלך אינדוקציה לאקינטים על ידי אלקטרופוריזה. הדגימות נלקחו לפי ימים )יום 14( 11, 7, 4, 0, + 3 דגימות נוספות: דגימת אקינטים מבודדים מאותה התרבית ) ak (,דגימת DNA גנומי כבקרה חיובית )D( ודגימת RNA כבקר השלילית )R(. אורך המקטעים נמדד על ידי סולם גדלים Marker100bp DNA Ladder )כל פרגמנט ארוך ב 100 זוגות בסיסים מהשני( ]משמאל[. מצד שמאל הגן.260bp שאורכו הצפוי cpca ומצד ימין הגן,268bp שגודלו הצפוי cpcb ביטוי גנים המקודדים לביוסינתזה ודגרדציה )פירוק( של ציאנופיצין. ביטוי גנים כמותי מלא CphA1 בניסוי שבדק את ביטוי הגן CphA1 לאורך האינדוקציה לאקינטים בשיטת,RT-QPCR נמצא כי ביטוי הגן היה נמוך לכל אורך תהליך השריית האקינטים למעט ביום השביעי ובדוגמת האקינטים המבודדים, סטיית התקן הגבוהה בביטוי הגן ביום השביעי מראה שהתוצאה בדגימה זו אינה אמינה. ישנה מובהקות בין רמת הביטוי הגבוהה של הגן באקינטים לכל השאר )איור 8(.

21 ak איור 8: ביטוי הגן cpha1 במהלך אינדוקציה לאקינטים על ידי.QPCR זמן האינדוקציה התבטא בימים, וביטוי הגן נמדד ע"פ מספר העותקים של ה- RNA שנשא את קידודו ומנורמל ביחס לביטוי ה- rrna 16S. cphb בניסוי שבדק את ביטוי הגן cphb לאורך האינדוקציה לאקינטים בשיטת,RT-QPCR נמצא כי ביטוי הגן עולה בשלבים מאוחרים יותר, לאחר 14 יום ובדוגמת האקינטים המבודדים. ישנה מובהקות סטטיסטית בתוצאות בין דוגמת האקינטים ובין דוגמה שנלקחה לאחר 14 י םו לבין הדוגמא שנלקחה בתחילת האינדוקציה. כלומר, בזמנים המאוחרים נצפה ביטוי גבוה יותר מאשר בתחילת האינדוקציה, כאשר לאחר 14 יום של אינדוקציה נצפה ביטוי מקסימלי )איור.) ak איור 9: ביטוי הגן cphb במהלך אינדוקציה לאקינטים על ידי.QPCR זמן האינדוקציה התבטא בימים, וביטוי הגן נמדד ע"פ מספר העותקים של ה- RNA שנשא את קידודו ומנורמל ביחס לביטוי הrRNA 16S.

22 21 ביטוי גנים חצי כמותי בניסוי שבו נעשה לשני הגנים cphb ו- cpha1 אלקטרופוריזה, נמצא כי: ב- -cpha1 פרגמנטים באורך הנכון )358 בסיסים(. זיהום של DNA גנומי זניח. )איור 10(. ב- cphb פרגמנטים באורך הנכון )300 בסיסים(. זיהום של DNA גנומי זניח)איור 10(. כזכור, השתמשנו באלקטרופוריזה לצורך וידוא שאנו מתעסקים עם הפרגמנט הנכון. אין משמעות לכמות, משום שהאלקטרופוריזה נעשתה לאחר PCR )כפי שהוסבר לעיל(. R D ak R D ak cphb cpha 1 איור 10: ביטוי הגנים cpha1 ו- cphb במהלך אינדוקציה לאקינטים על ידי אלקטרופוריזה. משך האינדוקציה התבטא בימים )יום 14( 11, 7, 4, 0, + 3 דגימות נוספות: דגימת אקינטים מבודדים מאותה התרבית ) ak (,דגימת DNA גנומי כבקרה חיובית )D( ודגימת RNA כבקרה שלילית )R(. אורך המקטעים נמדד על ידי סולם גדלים Marker 100bp DNA Ladder )כל פרגמנט ארוך ב 100 זוגות בסיסים מהשני ) ]משמאל[. מצד שמאל הגן cphb שגודלו הצפוי,300bp ומצד ימין הגן cpha1 שאורכו הצפוי.358bp יחד עם שאר הגנים שהורצו, הורץ גם הגן 16S )שכזכור rrna ביטויו גבוה ברוב המקרים ואינו משתנה(, וביטויי שאר הגנים הושוו אליו וחולקו בו על מנת לקבל ביטוי יחסי. הרצת תוצרי ה- QPCR של גן זה rrna( 16S( באלקטרופוריזה, מראה שהוגברו מקטעים באורך הרצוי )440 בסיסים(. בבקרה השלילית יש תוצרים, אך נתון זה )כמוסבר לעיל( נובע מהרצה לאחר PCR בן 35 סיבובים. )איור 11(. כזכור, השתמשנו באלקטרופוריזה לצורך וידוא שאנו מתעסקים עם הפרגמנט הנכון. אין משמעות לכמות, משום שהאלקטרופוריזה נעשתה לאחר PCR )שוב, כמוסבר לעיל(.

23 22 R D ak איור 11 :ביטוי הגן של ה- 16Sבמהלך rrna אינדוקציה לאקינטים על ידי אלקטרופוריזה. הדגימות נלקחו לפי ימים )יום 14( 11, 7, 4, 0, + 3 דגימות נוספות: דגימת אקינטים מבודדים מאותה התרבית ) ak (,דגימת DNA גנומי כבקרה חיובית )D( ודגימת RNA כבקרה שלילית )R(. אורך המקטעים נמדד על ידי סולם גדלים Marker 100bp DNA Ladder )מרחק בין כל שלב 100 בסיסים( ]משמאל[. אורכו של הגן:.440bp

24 23 דיון ומסקנות מטרת מחקר זה הייתה לבדוק השפעת אינדוקציה לאקינטים על רמת ביטוי הגנים האחראים לסינתזה של פיקוציאנינים ולביוסינתיזה ודגרדציה של ציאנופיצין באצה הכחולית.Aphanizomenon ovalisporum פיקוציאנין בניסוי שנערך על הגנים cpca ו- cpcb המקודדים לשרשראות אלפא ובתא בפיקוציאנין נמצא כי ישנה עלייה קלה בייצור ה mrna הנושא את הקידוד לשרשראות α ו β )בייחוד שרשראות β( בעת האינדוקציה לאקינטים, ולפיכך ניתן להניח כי ישנה עלייה קלה בייצור המערכת הפוטוסינתטית, בעוד ההשערה ניבאה שביטוי הגן ופעילות המערכת הפוטוסינתטית יקטנו. אנו שיערנו שביטוי החלבון ופעילות המערכת הפוטוסינתטית יקטנו לכל אורך האינדוקציה; הן משום שבאקינטים הפעילות המטבולית פוחתת ולפיכך גם המערכת הפוטוסינתטית פחות נדרשת, הן משום שלאקינטים אין אור בקרקעית )ומשום כך יעילות המערכת וכדאיות ההשקעה בה פוחתות( והן משום שנמצא המאמר של סוקניק( 7,)Sukenik et al 200 בו הוא משער כי מצא עדות לקיומם של פיקובילינים בתאים וגטטיביים ולהיעלמותם באקינטים. לעומת השערה זו, ראינו כי לא רק שאין ירידה בייצור המערכת, אלא יש אף עלייה קטנה בייצורה! כיוון שהתוצאות נגדו את ההשערה הסקנו בתחילה כי כנראה החלבונים שנמצאו במחקר של סוקניק אינם פיקובילינים, כפי שהוא סבר בתחילה, אלא חלבונים אחרים. אולם, בבדיקה מדוקדקת גילינו כי האקינטים במחקרו של סוקניק הופקו מתרבית בת 6-8 שבועות, לעומת האקינטים במחקר שלנו שבודדו לאחר שבועיים בלבד. ייתכן ופער זה בזמני הפקת האקינטים גרם לשינוי בתוצאות, שכן ייתכן שלאחר ששהו בקרקעית כל כך הרבה זמן התרחש באקינטים תהליך שגרם להיעלמות הפיקובילינים. לכן, אי אפשר להסיק ממחקר זה מסקנות לגבי מחקרו של סוקניק - האם הוא נכון, או אולי שגוי. כעת, כדי להסביר את התוצאות, הסקנו שבניגוד להנחת היסוד, ייצור המערכת אינו מעיד בהכרח על פעילותה הנוכחית של המערכת הפוטוסינטתית, אלא יכול להעיד על הכנה לפעילות עתידית; האקינט אכן אינו זקוק למערכת הפוטוסינתטית באופן מידי משום שהוא נמצא בקרקעית האגם )שם אין אור(, אך הוא יזדקק למערכת כאשר הוא ינבט, ולכן המערכת מיוצרת באקינטים במצב רדום, ונמצאת במצב "היכון" בהמתנה לנביטה. העובדה שהאצה נובטת כאשר קיימת אצלה מערכת פוטוסינתטית קיימת שלא זקוקה לבנייה מהווה יתרון סביבתי מובהק עבורה, משום שהמערכת מאפשרת לאצה התפתחות מהירה, ישירות עם נביטתה.

25 24 באשר לייצורה המוגבר קלות של המערכת, הוסק שהדבר נובע ככל הנראה מהקושי בייצור מערכת זו )בייחוד שרשראות ה- β שלה( בעת הנביטה, דבר המצריך מעט עודפים משרשראות אלה. אפשרות אחרת שנשקלה כדי להסביר את אי-הירידה בייצור המערכת היא שגם באקינטים מתבצעת פוטוסינתזה, ולכן הפער בין האקינטים לבין התאים הוגטטיביים אינו משמעותי. הסבר זה בעייתי ממספר בחינות: ראשית, לכל אורך האינדוקציה נצפתה עלייה קלה בייצור המערכת, ומהסבר זה נובע שבאקינטים ישנה פעילות פוטוסינתטית רבה יותר מאשר בתאים הוגטטיביים, או לכל הפחות דומה לה, ודבר זה אינו מתקבל על הדעת, שהרי באקינטים מתקיים מטבוליזם נמוך משמעותית מאשר בתאים וגטטיביים. תוצרי המערכת הפוטוסינתטית משמשים כחומרי אנרגיה למערכות אחרות, וכיוון שכולן מושבתות/נמצאות במצב פעולה נמוך ביותר, אין זה הגיוני שמערכת זו תפעל, בוודאי שלא בעוצמה רבה שכזו. עם זאת, ניתן לומר כי מאחר ותהליך ההתמיינות לאקינט דורש הרבה אנרגיה כמו גם מולקולות סוכר )לצורך המעטפת הנבנית על האקינט(, ומאחר ושתי הדרישות ניתנות להשגה על ידי תהליך הפוטוסינתזה -ייצור המערכת מוגבר מעט, אך זמן מה לאחר שהאקינט הבשיל ושקע לקרקעית המערכת אכן תפורק )או, לכל הפחות, ייצורה יהיה נמוך יותר(. הסבר זה אינו מגובה מהספרות הקיימת, משום שלא ידועים לנו תהליכים דומים בתוך האקינט המשתנים לאחר זמן מה. אולם, ניתן לומר שההשערה לעיל באשר למחקרו של סוקניק ]אודות השפעת הפרשי הזמנים בבידוד האקינטים על הימצאות פיקובילינים[, במידה והיא נכונה, תוכל לשמש כמקור כזה. אך, על כל פנים, השערה זו דרושה הוכחה. לכן - הסבר זה )הגברת פעילות המערכת ולאחר מכן פירוקה( טעון ניסוי כהוכחה. שנית, הסבר הפוטוסינתזה באקינטים בעייתי מכיוון שלאקינטים יש תנאי אור גרועים )כיוון שהם שקועים בקרקעית(, ואין זה הגיוני שהאצה תשקיע במערכת פוטוסינתטית פעילה בתנאי אור שכאלה. כלומר: אמנם הסבר זה תואם את התוצאות הקיימות, אך התוצאות הללו הושגו באקינטים שגודלו בתרבית עם אור, וייתכן שזו הסיבה בגללה המערכת הפוטוסינתטית לא פורקה. לעומת זאת, ייתכן ואם נערוך ניסוי זהה באקינטים "טבעיים" שיוצאו מהים )שם אין להם אור( התוצאות תראינה ירידה בייצור המערכת )ולו רק באקינטים(. עקב בעיות אלה ועוד, הוחלט לפסול את ההסבר המוצע לעיל ולשלול את האפשרות לפוטוסינתזה גבוהה באקינטים. לסיכום: באקינטים המערכת הפוטוסינתטית מיוצרת, ככל הנראה במצב רדום, כהכנה לעתיד יתרון בעת נביטה לתאים הוגטטיבים של האצה.

26 25 ציאנופיצין בניסוי שנערך על הגנים cpha1 ו- cphb המקודדים ל- Cyanophycine synthetase המייצר )ביוסינטיזה( ציאנופיצין ול- Cyanophycinase המפרק )ביודגרדציה( ציאנופיצין )בהתאמה(, נמצא כי במהלך אינדוקציה לאקינטים ישנה עלייה בביטוי שני הגנים כאשר הביטוי המקסימלי של שניהם נמצא באקינטים. מכאן ניתן להסיק כי יש עליה בייצור חומר התשמורת אך עם זאת ישנה עלייה גם בקצב פירוקו. תוצאה זו תואמת חלקית את ההשערה, שניבאה לכל אורך האינדוקציה עלייה בייצור חומר התשמורת אך ניבאה גם ירידה בקצב פירוקו, שכן ציפינו שככל שהאקינטים יתפתחו ויתבגרו כך הם ישמרו יותר ציאנופיצין אצלם, וישתמשו בו בצורה פחותה יותר, משום שהם ירצו לשמור אותו לנביטה. לעומת ההשערה, קיבלנו גם עלייה בייצור החומר וגם עלייה בקצב פירוקו. עקב התוצאות התואמות חלקית, הסקנו שאכן ישנה צבירה של ציאנופיצין בתאי האקינטים כמאגרים לשעת התרדמת ולשעת ההתעוררות, כמו ששוער. אולם, יחד עם זאת, מתרחש פירוק מוגבר )על ידי אנזימים( של שרשראות הציאנופיצין הקיימות על מנת להשתמש במרכיביהם כחומרי בניין לחומרים שונים הדרושים לאקינטים )כגון חנקן עבור נוקלאוטידים וכגון חומצות האמינו השלמות עבור חלבונים שונים הנצרכים לאקינט(. החנקן של הציאנופיצין חיוני עבור התא, משום שכזכור, האקינט מכפיל את הגנום שלו פי 5 עד פי 10, )2012 al.,,)sukenik et ולשם כך הוא נזקק לחנקן רב. מלבד זאת, מאגרי החנקן והפחמן )השלד של שרשראות הציאנופיצין( מהווים מקור חשוב ליסודות אלו עבור התא הווגטטיבי הנובט, ועל כן ניתן להעריך כי לריכוז ציאנופיצין בתא יש השפעה מכרעת על התפתחות הנביטה. בנוסף,אף לחומצות האמינו ארגינין ואספרטאט )המרכיבות את הציאנופיצין( יש חשיבות בפני עצמן; הן חיוניות לבנייה, לא רק של חלבונים, אלא אף של חומצות אמינו נוספות) 1994,)Bryant, ולכן נוכחותם היא דבר נדרש כאשר האקינט עוסק בייצור חלבונים שונים, הן לעתה הן לעתיד. כמובן, מכאן ניתן לשער שעל מנת שיישאר ציאנופיצין כחומר תשמורת לאקינטים, וכדי שאכן תפוצתם היחסית של חומצות האמינו אספרטאט וארגינין תהא גבוהה יותר באקינטים בוגרים מאשר בתאים הוגטטיביים, על קצב ייצור הציאנופיצין להיות גבוה מקצב פירוקו, שאילולא כן יתמעט הציאנופיצין ולא יישאר מספיק ציאנופיצין עבור האקינט הנובט בעתיד, וכמו כן גם לא תישאר תפוצה גבוהה כל כך של ארגינין ואספרטאט באקינט )שהרי הרבה מהחנקן ילך לטובת הנוקלאוטידים ולטובת צרכים חנקניים אחרים(. באשר להתאמה החלקית של ההשערה לתוצאות; ההשערה התבססה על מחקר קודם בו נמצא כי תפוצתם היחסית של חומצות האמינו אספרטאט וארגינין גבוהה יותר באקינטים בוגרים מאשר בתאים הוגטטיביים, ושוער שעלייה זו קשורה בצבירה של ציאנופיצין באקינטים )סוקניקוחוב', 2007(. אנו בדקנו את ההשערה הזו, ומצאנו כי היא נכונה אם כי,

27 26 ישנו גם פירוק של ציאנופיצין אותו לא חזינו, והוא הוסבר לעיל. לסיכום:ישנו פירוק של ציאנופיצין ישן לצורך בניית גופי האקינטים, ולעומתו ישנו גם ייצור של ציאנופיצין חדש כחומר תשמורת אשר נצבר לאחר ייצורו באקינטים הבנויים. יתרונות המחקר ומגבלותיו מחקר זה תרם רבות לידע אודות תהליך האינדוקציה לאקינטים באצה הכחולית.Aphanizomenon ovalisporum תרומה זו התרחשה במישורים שונים. לדוגמה, המחקר תרם ברמת מטרת המחקר המקורית הוספת ידע על המערכת הפוטוסינתטית ועל תהליכי בנייה ופירוק ציאנופיצין בעת אינדוקציה לאקינטים. ידע זה ישמש להכרת מחזור החיים של הציאנובקטריה, ותאפשר בע"ה בעתיד שליטה ובקרה בעת פריחות חוזרות. נוסף על כך, מחקר זה יוכל להוות בסיס למחקרים עתידיים בייחוד למחקרים על מערכות אלו: פוטוסינתזה, וחילופי חנקן באקינט. בנוסף, מחקר זה הוליד שאלות חדשות ופתח כיווני מחקר חדשים )כגון אלו שיינתנו להלן(. ואחרון חביב מחקר זה חיזק/שלל/הסביר מחקרים קודמים בתחום )כפי שנעשה לעיל(. מאידך, למחקר זה היו מספר מגבלות שהקשו על היכולת להשיג תוצאות מדויקות, ולכן יתכן ומגבלות אלה השפיעו גם על נכונות מסקנותיו. לדוגמה, במחקר זה נעשו 2 חזרות בלבד, ויש צורך בחזרות ביולוגיות נוספות על מנת לאשש את מסקנותינו. מגבלה אחרת שהקשתה על הסקת המסקנות היא מקור האקינטים הניסוי בוצע באקינטים שהופקו בתנאי מעבדה, וייתכן והתוצאות תהיינה שונות באקינטים שנלקחו מן האגם )הן מבחינת כמות האור שהייתה להם, דבר העלול להשפיע על ייצור המערכת הפוטוסינתטית, והן מבחינת הזמן העובר עליהם עד שהם נבדקים ייתכן ותהליכים מסוימים קורים כעבור זמן רב מהבשלת האקינטים, תהליכים כגון פירוק / ייצור של מערכות שונות(. מגבלה נוספת של המחקר הייתה שרמת הבקרה שלנו הייתה בשלב התיעתוק של הגן ולא בשלב התרגום שלו אנו בדקנו את הנוכחות של ה- mrna ולא את של החלבונים עצמם, וייתכן וישנו דיכוי בתרגום ה- mrna לחלבון כך שרמת ה- mrna שנמצאה אינה תואמת את מצב החלבונים.

28 27 כיווני מחקר בהמשך לסיום, מספר המלצות למחקרי המשך: 1. חזרה על הניסוי של ביטוי הגנים הנ"ל באקינטים בדוגמאות מקרקעית האגם )סדימנטים ( שנלקחו ממקומות שונים באגם ומשכבות שונות של הסדימנטים.)לצורך בדיקת ביטוי הגנים לאורך זמן לאחר האינדוקציה לאקינטים ]בתנאי האגם[(. 2. בדיקת היחס בציאנופיצין : ייצור לעומת פירוק אנו שיערנו בתום הדיון על הציאנופיצין כי ייצור הציאנופיצין גבוה מקצב פירוקו. אנו ממליצים לבדוק השערה זו, ולאמת אותה. 3. חזרה ברמת החלבון. כפי שהוסבר לעיל, הניסוי בוצע ברמת ה- RNA וייתכן והיה דיכוי בתרגום ה- mrna לחלבון, כך שרמת החלבונים שנמצאו בפועל הייתה שונה מרמת ה- mrna שנמצאה. על כן מומלץ לחזור ולבצע את הניסוי ברמת החלבון עצמו, ולא ברמת ביטוי גנים בלבד. 4. בדיקת חלקים אחרים של המערכת הפוטוסינתטית אנו בדקנו את ייצור הפיקוציאנין כמדד לייצור המערכת הפוטוסינתטית כולה )או לפחות הממברנות שלה(, אך ייתכן וישנו גורם המשפיע על ייצור הפיקוציאנין ואינו משפיע על ייצור המערכת / הממברנה כולה. לכן מומלץ לבדוק גם חלקים אחרים של המערכת )כגון כלורופיל( כדי לוודא את תוצאות ומסקנות מחקר זה )נוסף על המחקר של סוקניק( 2007,)Sukenik et al בו הוא גילה שחלקים מסויימים של המערכת הפוטוסינתטית אינם מפורקים באקינטים(. 5. לחזור על הניסוי עם תרבית שגדלה ב- BG )המצע של האצות הכחוליות( מלא ללא השריה לאקינטים, לבדיקת השפעת האינדוקציה לאקינטים דווקא על ביטוי הגנים, כלומר: נצרכת בדיקה על מנת לוודא שדווקא האינדוקציה וההתמיינות לאקינטים היו הגורמים שהשפיעו על השינויים בביטוי הגנים, ולא שמדובר בשינויים שהיו מתרחשים גם במקרה שהאינדוקציה לא הייתה מתרחשת )וגם במקרים שכן, כמו אצלנו(.

29 28 ביבליוגרפיה ברנהולץ, ח., פלד, ל. ווינקלר, ר. )2001(. פרקים במיקרוביולוגיה ובמערכות הגנה. ירושלים: המרכז להוראת המדעים, האוניברסיטה העברית. הדס, א., סוקניק, א., ויינר-מוציני, ד., פנקס, ר., מלינסקי-רושנסקי, נ., הדרי, מ. וקפלן-לוי, ר. ) 2008 (.תרדמת תאים ואורגניזמים אסטרטגיית שרידות ושימור בכחוליות. סיכום מחקרים בכנרת ,2008 הדס, א., קפלן, א., רימר, א. וסוקניק, א. ) 2011 (.חדירה והתבססות של ציאנובקטריה )אצות כחוליות( מסדרת ה- Nostocales בכנרת, חדשות הכנרת, , לופו, ע., הדס, א., מלינסקי-רושנסקי, נ., גל, ג. וסוקניק, א. ) 2010 (.תאי קיימא של כחוליות )אקינטים( בכנרת כימות, מציאה וחיזוי הפריחה של אפניזומנון, חדשות הכנרת, , סוקניק, א., הדס, א., גל, ג., לופו, ע., פנקס, ר., מלינסקי-רושנסקי, נ. וקפלן-לוי ר. )2008(. מחזור החיים של כחוליות וחיזוי פריחות בגופי מים, סיכום מחקרים בכנרת 2008, סוקניק, א., הדס, א., ויינר-מוציני, ד., פנקס, ר., מלינסקי-רושנסקי נ. וקפלן-לוי, ר. )2007(. תרדמת תאים אסטרטגיית הישרדות ושימור בציאנובקטריה, חדשות הכנרת, , עתידיה, י. )2004(. גנטיקה. ירושלים: משרד החינוך, התרבות והספורט. 16S.נדלה rrna gene.)2011( green genes מאתר,green genes בתאריך,19/7/2015 בכתובת: Boussiba, S., & Richmond, A.E. (1980).C-phycocyanin as a storage protein in the blue-green alga Spirulina platensis.archives of Microbiology, Volume 125, Issue 1-2, pp Bryant.D.A. (1994).The Molecular Biology of Cyanobacteria.Dordrecht: Kluwer Academic Publishers (Chapter 16). Bustin, S.A. (2000). Absolute quantification of mrna using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology, 25, Glazer, A.N (1989).Directional energy transfer in a photosynthetic antenna. Journal biologicalchemistry, Vol. 264, No. 1, Iseue of January 5, pp. 1-4, Madigan, M.T., Martinko, J.M., Stahl, D.A. & Clark, D.P. (2012).Brock biology of microorganisms.san Francisco: Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.

30 29 Rappolee, D.A., Mark, D., Banda, M.J &Werb, Z (1988).Wound macrophages express TGFalpha and other growth factors in vivo: analysis by mrna phenotyping. Science, 241, Sukenik, A., Beardall, J. and Hadas, O. (2007).Photosynthetic characterization of developing and mature akinetes of Aphanizomenonovalisporum (cyanoprokaryota) J. Phycol. 43: Sukenik, A., Hadas, O., Stojkovic, S., Malinsky-Rushansky, N., Viner-Motzini, Y., &Beardall, J. (2009). Fluorescence microscopy reveals variations in cellular composition during formation ofakinetes in the cyanobacterium Aphanizomenonovalisporum. European Journal of Phycology, 44(3), Sukenik, A., Kaplan-Levy, R. N., Welch, J. M. & Post, A. F. (2012).Massive multiplication of genome and ribosomes in dormant cells (akinetes) of Aphanizomenonovalisporum (Cyanobacteria). ISME J 6, Sukenik, A., Zohary, T. and Padisák, J. (2009).Cyanoprokaryota and Other Prokaryotic Algae. Encyclopedia of Inland Waters. Gene E. Likens. Oxford, Elsevier. 1: